超氧陰離子(Oxygen free radical, OFR)試劑盒說明書

                                                   微量法100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

生物體內(nèi)超氧陰離子等活性氧具有免疫和信號(hào)傳導(dǎo)的作用，但積累過多時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞膜及生物大分子產(chǎn)生破壞作用，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞和組織代謝異常，從而引起多種疾病。

測(cè)定原理：

超氧陰離子與鹽酸羥胺反應(yīng)生成NO₂^－，NO₂^－在對(duì)氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成紅色的偶氮化合物，在530nm處有特征吸收峰，根據(jù)ΔA值可以計(jì)算樣品中O₂^－含量，反應(yīng)式為NH₂OH + 2O₂^－ ＋H^＋ → NO₂^－ ＋ H₂O₂ ＋ H₂O。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、水浴鍋、離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、氯仿和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體110mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體15mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體15mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑四：氯仿，自備。

超氧陰離子提取：

1.        植物、動(dòng)物組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后，10000g，4℃，離心20min，取上清置于冰上待測(cè)。

2.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心20min，取上清置于冰上待測(cè)。

3.        血清或培養(yǎng)液：直接測(cè)定。

測(cè)定操作表：
分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長至530nm。

1、   操作表

超氧陰離子含量計(jì)算公式

a.        用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0242x - 0.0027，R²=0.9980

1. 組織：

（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

超氧陰離子含量（nmol/g 鮮重）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V反總÷(V樣÷V樣總×W)×2

                             =148.76×(ΔA+0.0027)÷W

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ g·min）=148.76×(ΔA+0.0027)÷W÷T

                                =7.44× (ΔA+0.0027)÷W

（2）按照蛋白質(zhì)濃度計(jì)算

超氧陰離子含量（nmol/mg prot）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V反總÷(V樣×Cpr)×2

                                             =148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ mg prot·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr÷T

                                      =7.44× (ΔA+0.0027)÷Cpr

2. 細(xì)菌，真菌：

超氧陰離子含量（nmol/10⁴ cell）= (ΔA+0.0027)÷0.0242× V反總÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)×2

= 148.76×(ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/10⁴ cell·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量÷T

=7.44× (ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量

3. 血清或培養(yǎng)液

超氧陰離子 含量（nmol/mL）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V反總÷V樣×2

=148.76× (ΔA+0.0027)

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/mL·min）= 148.76× (ΔA+0.0027) ÷T

= 7.44× (ΔA+0.0027)

V樣總：加入提取液體積，1 mL； V反總：反應(yīng)總體積，0.36mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.2mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，20min；2: 2分子O₂^－參與反應(yīng)生成1分子NO₂^－。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0121x - 0.0027，R² = 0.9980

1. 組織：

（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

超氧陰離子含量（nmol/g 鮮重）= (ΔA+0.0027)÷0.0121×V反總÷(V樣÷V樣總×W)×2

                             =297.52× (ΔA+0.0027)÷W

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ g·min）=297.52× (ΔA+0.0027)÷W÷T

                                =14.88× (ΔA+0.0027)÷W

（2）按照蛋白質(zhì)濃度計(jì)算

超氧陰離子含量（nmol/mg prot）= (ΔA+0.0027)÷0.0121×V反總÷(V樣×Cpr)×2

                                        =297.52× (ΔA+0.0027)÷Cpr

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ mg prot·min）= 297.52× (ΔA+0.0027)÷Cpr÷T

                                      =14.88× (ΔA+0.0027)÷Cpr

2. 細(xì)菌，真菌：

超氧陰離子含量（nmol/10⁴ cell）=(ΔA+0.0027)÷0.0121× V反總÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)×2

=297.52× (ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/10⁴ cell·min）=297.52× (ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量÷T

=14.88× (ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量

3. 血清或培養(yǎng)液

超氧陰離子 含量（nmol/mL）=(ΔA+0.0027)÷0.0121 ×V反總÷V樣×2

=297.52×(ΔA+0.0027)

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/mL·min）= 297.52×(ΔA+0.0027) ÷T

=14.88×(ΔA+0.0027)

V樣總：加入提取液體積，1 mL； V反總：反應(yīng)總體積，0.36mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.2mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，20min；2：2分子O₂^－參與反應(yīng)生成1分子NO₂^－。

注意事項(xiàng)：

1、   OD值大于1，樣品適當(dāng)稀釋再測(cè)定，注意計(jì)算公式里乘以稀釋倍數(shù)。

2、   樣品制備好后，立刻進(jìn)行測(cè)定，請(qǐng)勿將樣品進(jìn)行長時(shí)間的低溫保存，以免影響測(cè)定結(jié)果。

3、   試劑四有一定的毒性，請(qǐng)操作時(shí)做好防護(hù)措施。