α-酮戊二酸脫氫酶（α-KGDH）活性測定試劑盒說明書

                                        微量法100管/96樣

注   意 ：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

α-KGDH（EC 1.2.4.2）廣泛存在于動物、植物微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中，是三羧酸循環(huán)調控關鍵酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔酶A。

測定原理：

α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD⁺ 和輔酶A生成琥珀酰輔酶A、 二氧化碳和 NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：100mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：20mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：1.5mL×1支，-20℃保存；

試劑四：液體20mL×1瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1瓶，-20℃保存；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、   稱取約0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、   將勻漿600g，4℃離心5min。

3、   棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

4、   上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的α-KGDH（此步可選做）。

5、   在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復30次），用于線粒體α-KGDH活性測定。

測定步驟：

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm，蒸餾水調零。

2、  樣本測定

（1）在試劑五中加入18mL試劑四充分溶解，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min；現(xiàn)配現(xiàn)用；

（2）在試劑六中加入1mL蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑六和180μL試劑五，混勻，立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

α-KGDH活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

 α-KGDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

 α-KGDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=325×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

α-KGDH活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.65×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應時間，2min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。

α-KGDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。

α-KGDH活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=650×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。

α-KGDH活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.3×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應時間，2min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。